Чинники, від яких залежить швидкість ферментативної реакції. Залежність швидкості ферментативних реакцій від концентрації субстратів, ферментів, температури Залежність швидкості реакції від кількості ферменту

Основи кінетики ферментативних процесів було закладено у працях Міхаеліса і Ментен, зокрема у рівнянні ферментосубстратного комплексу.

У кінетикою ферментативних процесів розуміють розділ науки про ферменти, що вивчає залежність швидкості ферментативної реакції від хімічної природи субстрату, умов середовища, а також сторонніх факторів, що впливають на перебіг реакції.
Коли концентрація субстрату досить велика, вона вже не впливає на швидкість, бо остання стала максимальною (свідчення того, що весь фермент пов'язаний з субстратом).
Дослідження активності ферментів проводять при великих концентраціях субстратів (нульовий порядок реакції). У умовах всі зміни швидкості реакції залежатимуть лише кількості ферменту. Але у живих клітинах концентрації субстрату, як правило, далекі від насичення ферментів. Це означає, що ферменти у клітинах використовують не всю свою міць.
Залежність швидкості ферментативної реакції кількості ферменту
Якщо субстрат перебуває у надлишку, що має місце у експериментальних умовах, то швидкість реакції пропорційна кількості ферменту. Але якщо кількість ферменту збільшити настільки, щоб субстрат не є в надлишку, то така пропорційність порушиться.
Швидкість ферментативної реакції лінійно зростає із збільшенням вмісту ферменту. Але надмірне зростання концентрації ферменту призводить до того, що субстрату стає менше, ніж ферменту, і це проявляється зменшенням наростання швидкості реакції.
Вплив на ферменти модуляторів
Активність ферментів може змінюватися як зміною кількості субстрату, ферменту, рН середовища, а й під впливом різних хімічних речовин. Речовини, що впливають перебіг ферментативних реакцій, називаються їх модуляторами, чи эффекторами. Вони поділяються на активатори та інгібітори, тобто під їх впливом реакція може прискорюватися або сповільнюватись. Вивчення дії модуляторів ферментів має практичного значення, оскільки дозволяє глибше зрозуміти природу дії ферментів. Деякі їх відіграють роль природних регуляторів метаболізму. Існує багато типів модуляторів активності ферментів, що відрізняються між собою за будовою та механізмом дії.
активатори ферментів
Роль активаторів можуть грати як органічні (жовчні кислоти, ферменти та ін.), і неорганічні речовини (іони металів, аніони). Нерідко трапляються випадки, коли та сама речовина щодо одного ферменту є активатором, а щодо іншого – інгібітором. Іони металів бувають дуже специфічними активаторами для певних ферментів. Вони можуть сприяти приєднанню субстрату до ферменту, брати участь у формуванні третинної структури або бути частиною активного центру. Іони багатьох металів (натрію, калію, кальцію, магнію, заліза, міді та ін.) є обов'язковими компонентами, які необхідні для нормального функціонування багатьох ферментів. Іноді деяких ферментів потрібно кілька різних іонів. Наприклад, для Na +, К + -АТФази, що здійснює транспорт іонів через плазматичну мембрану, необхідні для нормального функціонування іони калію, натрію та магнію.
Метали можуть входити до складу простетичної групи ферментів. Наприклад, залізо у складі порфіринових сполук є необхідним компонентом ферментів цитохромної системи, каталази та пероксидази; кобальт входить до простетичної групи гомоцистеїнтрансметилази та метилмалонілізомерази ферментів; мідь – до аскорбатоксидази; марганець є активатором ізоцитратдегідрогенази.
Металоферментів, що містять у своєму складі переважно двох-і тривалентні іони утворюють із залишками функціональних груп амінокислот та відповідними іонами клешнеподібні хелатні сполуки. У таких сполуках іони надають ферментам певної просторової структури та сприяють утворенню ферментосубстратних комплексів. Деякі ферменти за відсутності металів просто не виявляють ферментативної дії. Наприклад, карбоангідрази без цинку не має властивостей ферменту і дію цинку не можна замінити жодним іншим іоном.
Існує група ферментів, що активуються за допомогою цАМФ. Такі ферменти називаються протеїнкінази. Механізм їхньої активації такий. Протеїнкіназа складається з двох субодиниць: каталітичної, що містить активний центр, та регуляторної, в якій розташований центр зв'язування цАМФ. Фермент неактивний, тому що активний центр закритий. Він звільняється лише при взаємодії ц-АМФ та регуляторного центру ферменту.

КУРСОВА РОБОТА

Кінетика ферментативних реакцій

Вступ

Основу життєдіяльності будь-якого організму становлять хімічні процеси. Майже всі реакції в живому організмі протікають за участю природних біокаталізаторів - ферментів.

Берцеліус 1835 р. вперше припустив, що реакції живого організму здійснюються завдяки новій силі, яку він назвав «каталітичною». Цю ідею він обґрунтував головним чином експериментальним спостереженням: діастаза з картоплі гідролізує крохмаль швидше, ніж сірчана кислота. Вже 1878 р. Куне назвав речовину, що має каталітичної силою у живому організмі, ферментом.

Кінетика дії ферментів - це розділ ферментології, що вивчає залежність швидкості реакції, що каталізується ферментами, від хімічної природи та умов взаємодії субстрату з ферментом, а також від факторів середовища. Інакше висловлюючись, кінетика ферментів дозволяє зрозуміти природу молекулярних механізмів дії чинників, які впливають швидкість ферментативного каталізу. Цей розділ утворився на стику таких наук, як біохімія, фізика та математика. Сама рання спроба математично описати ферментативні реакції була зроблена Дюкло в 1898 році.

Насправді цей розділ вивчення ферментів дуже важливий у наш час, а саме для практичної медицини. Він дає фармакологам інструмент спрямованої зміни метаболізму клітини, величезну кількість фармацевтичних препаратів та різні отрути – це інгібітори ферментів.

Метою даної є розгляд питання залежності швидкості реакції від різних факторів, яким чином можна контролювати швидкість реакцій і як її можна визначити.

1. Кінетика Міхаеліса – Ментен

Попередні експерименти з вивчення кінетики ферментативних реакцій показали, що швидкість реакції, всупереч теоретичним очікуванням, не залежить від концентрації ферменту (Е) та субстрату (S) таким чином, як у разі звичайної реакції другого порядку.

Браун і незалежно від нього Анрі вперше висунули гіпотезу про утворення під час реакції фермент-субстратного комплексу. Потім це припущення підтвердили три експериментальні факти:

а) папаїн утворював нерозчинне з'єднання з фібрином (Вюртц, 1880);

б) субстрат інвертази сахароза могла захищати фермент від теплової денатурації (О "Салліван і Томпсон, 1890);

в) було показано, що ферменти є стереохімічними специфічними каталізаторами (Фішер, 1898-1899).

Вони ввели поняття максимальної швидкості та показали, що крива насичення(тобто залежність швидкості реакції від концентрації субстрату) є рівнобічною гіперболою. Вони довели, що максимально спостерігається швидкість є з асимптот до кривої, а відрізок, отсекаемый на осі абсцис (у сфері її негативних значень) другий асимптотою, тобто. константа в рівнянні швидкості, дорівнює за абсолютним значенням концентрації субстрату, необхідної для досягнення половини максимальної швидкості.

Міхаеліс та Ментен припустили, що швидкість реакції визначається розпадом комплексу ES, тобто. константою k 2 . Це можливо лише за умови, що k 2 - Найменша з констант швидкості. У цьому випадку рівновага між ферментом-субстратним комплексом, вільним ферментом і субстратом встановлюється швидко в порівнянні зі швидкістю реакції (швидко встановлюється рівновага).

Початкову швидкість реакції можна виразити такою формулою:

v = k 2

Оскільки константа дисоціації фермент-субстратного комплексу дорівнює

K S = [E] [S] / = k -1 / k 1

то концентрацію вільного ферменту можна виразити як

[E] = K S / [S]

Загальна концентрація ферменту у реакційній суміші визначається формулою

[Е] т = [Е] + [ЕS] = K S [ЕS] / [S] + [ЕS]

Реакція досягає максимальної швидкості, коли концентрація субстрату досить висока, щоб усі молекули ферменту перебували як комплексу ЕS (нескінченно великий надлишок субстрату). Відношення початкової швидкості до теоретично можливої ​​максимальної швидкості дорівнює відношенню [ЕS] до [Е] т:

v / V max = / [E] т = / (K S / [S] + ) = 1 / (K S + [S] +1)

Це класичне рівняння Міхаелісаі Ментен,яке з часу його публікації у 1913 р. стало фундаментальним принципом усіх кінетичних досліджень ферментів протягом десятиліть та з деякими обмеженнями залишилося таким досі.

Пізніше було показано, що оригінальне рівняння Міхаеліса – Ментен передбачало наявність кількох обмежень. Воно справедливе, тобто. правильно описує кінетику реакції, що каталізується даним ферментом, лише за умови виконання всіх наступних обмежувальних умов:

) утворюється кінетично стійкий фермент-субстратний комплекс;

) константа K S є константою дисоціації фермент-субстратного комплексу: це справедливо, тільки якщо;

) концентрація субстрату не змінюється під час реакції, тобто. концентрація вільного субстрату дорівнює його початковій концентрації;

) продукт реакції швидко відщеплюється від ферменту, тобто. не утворюється кінетично значної кількості ЕS комплексу;

) друга стадія реакції необоротна; точніше, ми беремо до уваги лише початкову швидкість, коли зворотної реакцією (через фактичної відсутності продукту) ще можна знехтувати;

) з кожним активним центром ферменту зв'язується лише одна молекула субстрату;

) для всіх реагуючих речовин замість активностей можна використовувати їх концентрацію.

Рівняння Міхаеліса - Ментен служить відправною точкою за будь-якого кількісному описі дії ферментів. Слід наголосити, що кінетична поведінка більшості ферментів значно складніша, ніж це випливає з ідеалізованої схеми, що лежить в основі рівняння Міхаеліса – Ментен. При виведенні цього рівняння передбачається, що існує лише один фермент-субстратний комплекс. Тим часом насправді у більшості ферментативних реакцій утворюється щонайменше два або три таких комплекси, що виникають у певній послідовності.

Тут через EZ позначений комплекс, що відповідає істинному перехідному стану, а через ЕР – комплекс між ферментом та продуктом реакції. Можна зазначити також, що у більшості ферментативних реакцій бере участь більше субстрату і утворюється відповідно два чи більше продуктів. В реакції з двома субстратами, S 1 і S 2 може утворитися три фермент-субстратних комплексу, а саме ES 1 , ES 2 і ES 1 S 2 . Якщо в результаті реакції виходить два продукти, P 1 і P 2 то може існувати щонайменше ще три додаткові комплекси EP 1 EP 2 і EP 1 P 2 . У таких реакціях є багато проміжних стадій, кожна з яких характеризується константою швидкості. Кінетичний аналіз ферментативних реакцій, в яких беруть участь дві реагуючі речовини або більше, часто виявляється складним і вимагає використання електронних обчислювальних машин. Тим не менш, при аналізі кінетики всіх ферментативних реакцій відправною точкою завжди є розглянуте вище рівняння Міхаеліса – Ментен.

1.1 Природа константиKу рівнянні

рівняння ферментативний реакція кінетика

Другий постулат формулює, що константа K S у рівнянні є константою дисоціації фермент-субстратного комплексу.

Бріггс і Холдейн в 1925 р. довели, що вихідне рівняння Міхаеліса - Ментен справедливе лише за , тобто. коли рівновага елементарної стадії E+S ES встановлюється дуже швидко, порівняно зі швидкістю наступної стадії. Тому такі кінетичні механізми (що підпорядковуються початковій умові Міхаеліса - Ментен і мають одну повільну елементарну стадію, щодо якої рівноваги у всіх інших елементарних стадіях встановлюються швидко) називаються такими, що задовольняють припущення про «швидку рівновагу». Якщо, однак, k 2 по порядку величини можна порівняти з k -1 , зміну концентрації фермент-субстратного комплексу в часі можна виразити наступним диференціальним рівнянням:

d / dt = k 1 [E] [S] - k -1 - k 2

Оскільки розглядаємо початкову швидкість реакції, тобто. момент, коли зворотна реакція ще не відбувається, а передстаціонарна стадія вже пройшла, то внаслідок надлишку субстрату кількість фермент-субстратного комплексу, що утворився, дорівнює кількості розпався (принцип стаціонарності, або кінетика Бріггса і Холдейна, або принцип Боденштейна в хімічній кінетиці) і справедливо, що

d/dt = 0

Підставивши це у диференціальне рівняння, отримаємо вираз для концентрації вільного ферменту:

[E] = (k -1 + k 2) / k 1 [S]

[E] T = [E] + = [(k -1 + k 2) / k -1 [S] + 1] =

= (k -1 + k 2 + k -1 [S]) / k 1 [S]

Рівняння стаціонарного стану:

K 1 [S] [E] T/(k -1 + k 2 + k 1 [S])

Т.к. v = k 2 то отримаємо, що

v = k 1 k 2 [S] [E] T / (k -1 + k 2 + k 1 [S]) = k 2 [S] [E] T / [(k -1 + k 2) / k 1 + [S]]

В цьому випадку

V max = k 2 [E] T

і дорівнює максимальної швидкості, отриманої за рівнянням Міхаеліса – Ментен. Тим не менш, константа в знаменнику рівняння Міхаеліса - Ментен - не K S , тобто. не константа дисоціації фермент-субстратного комплексу, а так звана константа Міхаеліса:

K m = (k -1 + k 2) / k 1

K m дорівнює K S тільки якщо .

У разі константа у знаменнику рівняння швидкості виражається формулою

K k = k 2 / k 1

і називається, згідно Ван Слайку, кінетичною константою.

Рівняння стаціонарного стану можна також отримати з диференціального рівняння без припущення, що d/dt = 0. Якщо підставимо значення [E] = [E] T – у диференціальне рівняння, після перетворень отримаємо

= (k 1 [S] [E] T - d / dt) / (k 1 [S] + k -1 + k 2)

Для того, щоб з цього рівняння отримати рівняння стаціонарного стану, не обов'язково має бути d/dt = 0. Достатньо, щоб виконувалася нерівність d/dt<< k 1 [S] [E] T . Этим объясняется, почему можно достичь хорошего приближения в течение длительного времени при использовании принципа стационарности.

Диференційоване рівняння стаціонарного стану виглядає так:

d / dt = T / (k 1 [S] + k -1 + k 2) 2] (d [S] / dt)

Це вираз, очевидно, не дорівнює 0.

1.2 Перетворення рівняння Міхаеліса – Ментен

Вихідне рівняння Міхаеліса – Ментен є рівнянням гіперболи, де одна з констант (V max) – асимптота до кривої. Інша константа (K m), негативне значення якої визначається другою асимптотою, дорівнює концентрації субстрату, необхідної для досягнення V max /2. У цьому легко переконатися, тому що якщо

v = V max / 2, то

Vmax/2 = Vmax[S]/(Km+[S])

Vmax/Vmax=1=2[S]/(Km+[S]) m+[S]=2[S], тобто. [S] = K m при v = V max /2.

Рівняння Міхаеліса - Ментен можна алгебраїчно перетворити на інші форми, зручніші для графічного представлення експериментальних даних. Одне з найпоширеніших перетворень зводиться просто до того, що прирівнюють один одному величини, обернені до лівої та правої частини рівняння

В результаті перетворення отримуємо вираз

яке носить назву рівняння Лайнуівера-Берка. Відповідно до цього рівняння, графік, побудований в координатах 1/[S] і 1/v, являє собою пряму, тангенс кута нахилу якої дорівнює K m /V max а відрізок, що відсікається на осі ординат, дорівнює 1/V max . Такий графік, побудований за методом подвійних зворотних величин, має ту перевагу, що дає можливість більш точно визначити V max ; на кривій, побудованої в координатах [S] та v, V max є асимптотичною величиною і визначається значно менш точно. Відрізок, що відсікається на осі абсцис, на графіку Лайнуівера-Берка дорівнює -1/Km. З цього графіка можна також отримати цінну інформацію, що стосується інгібування ферменту.

Інше перетворення рівняння Міхаеліса-Ментен полягає в тому, що обидві частини рівняння Лайнуівера-Берка множать на V max *v і після деяких додаткових перетворень отримують

Відповідний графік у координатах v і v/[S] представляє е 4, рис. 1]. Такий графік ( графік Еді-Хофсті) не тільки дає можливість дуже просто визначити величини V max і K m , але і дозволяє виявити можливі відхилення від лінійності, які не виявляються на графіку Лайнуівера-Берка.

Рівняння також можна лінеаризувати в іншій формі

[S] / v = K m / V max + [S] / V max

І тут слід будувати залежність [S] / v від [S]. Нахил отриманої прямої дорівнює 1/V max; відрізки, що відсікаються на осях ординат та абсцис, рівні (Km/Vmax) та (-Km) відповідно. На ім'я автора цей графік називають графіком Хейнса.

Статистичний аналіз показав, що методи Еді – Хофсті та Хейнса дають більш точні результати, ніж метод Лайнуівера – Берка. Причиною цього є те, що в графіках Еді - Хофсті та Хейнса і залежні, і незалежні змінні входять до величин, що відкладаються на обох осях координат.

1.3 Вплив концентрації субстрату на кінетику реакції

У багатьох випадках умова сталості концентрації субстрату не виконується. З одного боку, надлишок субстрату не використовується в реакції in vitro з деякими ферментами через інгібування ферментативної активності субстрату, що часто відбувається. У цьому випадку можна застосовувати лише оптимальну концентрацію, і це не завжди забезпечує надлишок субстрату, необхідний для виконання кінетичних рівнянь обговорюваних вище механізмів. Більш того, у клітині in vivo надлишок субстрату, необхідний для здійснення цієї умови, зазвичай не досягається.

У ферментативних реакціях, де субстрат не знаходиться у надлишку і, отже, його концентрація змінюється в ході реакції, константа дисоціації фермент-субстратного комплексу дорівнює

K S = ([S] 0 - - [P]) [E] T - )/

([S] 0 – концентрація субстрату при t = 0). І тут початкова швидкість реакції (в стаціонарному стані) визначається формулою

v = V max / (K m +)

де - Концентрація субстрату в момент часу.

Проте можна написати приблизне рішення для двох випадків, коли [S] про = :

) якщо це нерівність виконується через великі значення t, тобто. коли понад 5% від початкової концентрації субстрату витратилося під час реакції;

) якщо концентрацію ферменту не можна знехтувати порівняно з концентрацією субстрату і, таким чином, потрібно брати до уваги концентрацію фермент-субстратного комплексу.

Якщо t велике, а концентрація зневажливо мала порівняно з [S] 0 , то рівняння константи дисоціації фермент-субстратного комплексу перетворюється на таке:

K S = ([S] 0 - [P]) ([E] T - ) /

Для значення концентрації, яка змінюється в ході реакції, задовільним наближенням є значення ([S] 0 + )/2. Оскільки = [S] 0 - [Р], середню швидкість; можна висловити як

Підставивши цей вираз і приблизне значення в

v = V max / (K m +),

отримаємо:

При порівнянні значень, розрахованих з урахуванням цього наближення, зі значеннями, отриманими з точного, проінтегрованого рівняння Міхаеліса - Ментен, виявляється, що помилка у визначенні K m становить 1 та 4% при витрачанні 30 та 50% субстрату відповідно. Отже, помилка при наближенні незначна порівняно з помилкою вимірювання.

Коли витрата субстрату не перевищує 5% початкової концентрації, але концентрація ферменту така велика, що в порівнянні з [S] 0 не можна не враховувати, константа дисоціації фермент-субстратного комплексу дорівнює:

K s = ([S] 0 - ) ([E] T - ) /

Його рішення щодо дає

З двох можливих рішень може бути обрано лише негативне, тому що тільки воно задовольняє початковим умовам: = 0 при [S] 0 = 0 або [Е] T = 0. За аналогією з рівнянням відношення v/V max ми отримали рівняння початкової швидкості. Квадратне рівняння, отримане з рівняння константи дисоціації фермент-субстратного комплексу, знайдену трохи вище, за допомогою формул v = k 2 і V max = k 2 [E] T можна привести до наступного виду:

[S] 0 V max / v = K s V max / (V max - v) + [E] T

Слід врахувати два граничні випадки. У першому випадку [S]<

v = (Vmax/Km) [S] = k[S]

Таким чином, ми отримали реакцію першого порядку і k=V max /K m - кінетичну константу першого порядку. Її фактична розмірність - час -1 , але є комбінацією констант швидкості першого і другого порядків кількох елементарних стадій, тобто. k 1 k 2 [E] T/(k -1 + k 2) . При умовах першого порядку, що здається, k є мірою проходження реакції.

Інший граничний випадок: [S] >> Km. Тут константа K m мізерно мала в порівнянні з [S], і, таким чином, отримуємо v = V max.

1.4 Утворення кінетично стійкого комплексу фермент – продукт

Якщо в ході реакції відбувається утворення кінетично стійкого комплексу фермент-продукт, механізм реакції виглядає наступним чином:

Застосувавши припущення про стаціонарний стан, можна написати диференціальні рівняння:

d / dt = k 1 [E] [S] + k -2 - (k -1 + k 2) = 0 / dt = k 2 - (k -2 + k 3) = 0

З цих рівнянь випливає, що

= [(k -2 + k 3) / k 2]

[E] = [(k -1 k -2 + k -1 k -3 + k 2 k 3) / k 1 k 2 [S]]

Оскільки v = k 3

та [E] T = [E] + + =

= [(k -1 k -2 + k -1 k -3 + k 2 k 3) / k 1 k 2 [S] + (k -2 + k 3) / k 2 + 1] =

= ((k -2 + k 3) + k 1 k 2 [S]] / k 1 k 2 [S])

отримуємо

K 1 k 2 [S] [E] T / (k -2 + k 3 + k 2)] = k 1 k 2 k 3 [S] [E] T / (k -2 + k 3 + k 2) ] =

= [E] T [S] / [(k -1 k -2 + k -1 k -3 + k 2 k 3) / k 1 (k -2 + k 3 + k 2) + [S]]

Тобто

V max = [E] Tm = (k -1 k -2 + k -1 k -3 + k 2 k 3) / k 1 (k -2 + k 3 + k 2)

І тут дуже складно обчислити конкретні значення індивідуальних констант швидкості, оскільки прямо виміряти можна лише їх ставлення. Ситуація ще більше ускладнюється при ускладненні механізму ферментативної реакції, коли в реакції беруть участь більше двох комплексів, тому що кількість констант швидкості в рівнянні, природно, набагато більша, і їх співвідношення також складніше.

Однак ситуація спрощується, якщо після оборотної реакції утворення першого комплексу наступні елементарні стадії необоротні. Важливими представниками ферментів, що підпорядковуються цьому механізму, є протеолітичні ферменти та естерази. Механізм їхньої реакції можна записати так:

де ES` - ацилферментне проміжне з'єднання, яке розкладається під дією води. Ми можемо написати

V max = k 2 k 3 [E] 0 / (k 2 + k 3) = k кат [E] 0m = k 3 (k -1 + k 2) / (k 2 + k 3) k 1 кат / K m = k 2 k 1 / (k -1 + k 2) = k 2 / K m '

Константа Міхаеліса стадії ацилювання - K m "K s. Чим більше відношення k кат / K m, тим вище специфічність субстрату.

Визначення констант спрощується, якщо експеримент проводять у присутності нуклеофільного агента (N), здатного конкурувати з водою. Тоді

k 3 = k 3 ' і P i (i = 1, 2, 3) – продукти.

vi = k кат, i [S] / (K m + [S]) кат, 1 = k 2 (k 3 + k 4 [N]) / (k 2 + k 3 + k 4 [N]) кат, 2 = k 2 k 3 / (k 2 + k 3 + k 4 [N]) кат, 3 = k 2 k 4 [N] / (k 2 + k 3 + k 4 [N]) m = K s ( k 3 + k 4 [N]) / (k 2 + k 3 + k 4 [N])

/v N = K s (k 3 + k 4 [N]) / k 2 k 3 [S] + (k 2 + k 3 + k 4 [N]) / k 2 k 3

Оскільки відомо, що K s /k 2 = K m / k кат, і якщо нуклеофіл відсутній, то

1/v = K s / k 2 [S] + (k 2 + k 3) / k 2 k 3

і визначення констант можна використовувати точку перетину прямих в координатах 1/v N (і 1/v) - 1/[S]. Дві прямі лінії у подвійних зворотних координатах перетинаються у другому квадранті. У відсутності нуклеофіла точка перетину прямої з вертикальною віссю визначається як 1/V max і 1/k кат , і з горизонтальною віссю - як -1/K m . Координати точки перетину двох прямих: -1/K s та 1/k 3 . Відстань між 1/V max та 1/k 3 дорівнює 1/k 2 .

1.5 Аналіз повної кінетичної кривої реакції

Рівняння Міхаеліса - Ментен у вихідному вигляді належить лише до незворотних реакцій, тобто. до реакцій, де розглядається лише початкова швидкість, а зворотна реакція не проявляється через недостатню кількість продукту і впливає швидкість реакції. У разі необоротної реакції, повну кінетичну криву можна легко аналізувати (для довільного інтервалу часу t ), інтегруючи вихідне рівняння Міхаеліса – Ментен. В цьому випадку, отже, зберігається припущення, що в ході реакції утворюється лише один проміжний фермент-субстратний комплекс. Тому що для інтервалу часу t не ставиться жодних обмежень, концентрація субстрату на момент аналізу може бути рівної спочатку введеної його концентрації. Таким чином, також необхідно брати до уваги зміну [S] під час реакції. Нехай S 0 - початкова концентрація субстрату (S 0 - y ) - Концентрація в момент часу t . Тоді, на основі вихідного рівняння Міхаеліса – Ментен (якщо y - кількість перетвореного субстрату), ми можемо написати

dy / dt = V max (S 0 - y) / (K m +S 0 - y)

Взявши зворотні величини та розділивши змінні, інтегруємо по y в межах від 0 до y (V max позначена як V):

(2,303/t) lg = V/K m - (1/K m) (y/t)

Таким чином, побудувавши графік залежності лівої частини рівняння від y/t (координати Фостера-Німанна) , отримаємо пряму лінію із нахилом (-1/K m) , відсікає на осі ординат відрізок (V/K m) , але в осі абсцис - відрізок V. Інтегральне рівняння можна також лінеаризувати по-іншому:

t/2,3031 lg = y/2,303 V lg + K m/V

або t/y = 2,3031 K m lg / V y +1/V

Якщо ми вивчаємо оборотну реакцію, необхідно звертати увагу на те, з яким часовим інтервалом ми маємо справу. У момент змішування ферменту із субстратом починається так звана передстаціонарна фаза тривалістю кілька мікро- або мілісекунд, протягом якої утворюються фермент-субстратні комплекси, що відповідають стаціонарному стану. При вивченні оборотних реакцій досить протяжних відрізках часу ця фаза не відіграє значної ролі, так як у цій фазі реакція не протікає з повною швидкістю в жодному з напрямків.

Для реакції, що йде зліва направо, фермент-субстратні комплекси, що беруть участь у реакції, досягають швидкості лімітуючої концентрації тільки в кінці передстаціонарної фази. Квазистаціонарний стан, в якому концентрації швидкість визначальних фермент-субстратних комплексів наближаються до максимальних значень концентрацій у стаціонарному стані, триває кілька десятих часток секунди або секунди. Під час цієї фази швидкість утворення продукту (або витрати субстрату) практично лінійна у часі. Теоретично тут утворення продукту ще не відбулося, а практично його концентрація настільки мала, що швидкість зворотної реакції не впливає на швидкість прямої. Ця лінійна фаза називається початковою швидкістю реакції, досі ми лише її й брали до уваги.

Реакція праворуч наліво у наступній фазі також прискорюється через поступове збільшення концентрації продукту (перехідний стан;спостерігається досі лінійність у часі зникає). Ця фаза триває до того часу, поки швидкість реакції зліва направо стає рівної швидкості реакції справа наліво. Це - стан динамічної рівноваги,оскільки реакція безперервно продовжується в обох напрямках з однаковою швидкістю.

2. Чинники, від яких залежить швидкість ферментативної реакції

.1 Залежність швидкості ферментативної реакції від температури

З підвищенням температури середовища швидкість ферментативної реакції збільшується, досягаючи максимуму за якоїсь оптимальної температури, а потім падає до нуля. Для хімічних реакцій існує правило, що при підвищенні температури на 10 ° С швидкість реакції збільшується вдвічі-втричі. Для ферментативних реакцій цей температурний коефіцієнт нижче: на кожні 10°С швидкість реакції збільшується вдвічі і навіть менше. Зниження швидкості реакції, що настає за цим, до нуля свідчить про денатурацію ферментного блоку. Оптимальні значення температури більшості ферментів перебувають у межах 20 - 40 0 ​​З. Термолабильность ферментів пов'язані з їх білковим будовою. Деякі ферменти денатурують вже за нормальної температури близько 40 0 ​​З, але основна частина їх инактивируется при температурах вище 40 - 50 0 З. Окремі ферменти инактивирует холод, тобто. при температурах, близьких до 0 С, настає денатурація.

Підвищення температури тіла (гарячковий стан) прискорює біохімічні реакції, які каталізуються ферментами. Неважко підрахувати, що збільшення температури тіла на кожний градус підвищує швидкість реакції приблизно на 20%. За високих температур близько 39-40°С марнотратне використання ендогенних субстратів у клітинах хворого організму обов'язково потрібно заповнювати їх надходження з їжею. Крім того, при температурі близько 40°С частина термолабільних ферментів може денатуруватися, що порушує природний хід біохімічних процесів.

Низька температура викликає оборотну інактивацію ферментів внаслідок незначного зміни його просторової структури, але достатнього порушення відповідної зміни активного центру і молекул субстрату.

2.2 Залежність швидкості реакції від рН середовища

Більшість ферментів є певне значення рН, у якому їх активність максимальна; вище та нижче цього значення рН активність цих ферментів зменшується. Однак не у всіх випадках криві, що описують залежність активності ферменту від рН, мають дзвонову форму; іноді ця залежність може виражатися також прямою. Залежність швидкості ферментативної реакції від рН переважно свідчить про стан функціональних груп активного центру ферменту. Зміна рН середовища впливає на іонізацію кислих та основних груп амінокислотних залишків активного центру, які беруть участь у зв'язуванні субстрату (в контактній ділянці), або в його перетворенні (в каталітичній ділянці). Тому специфічний вплив рН може бути викликаний або зміною спорідненості субстрату до ферменту, або зміною каталітичної активності ферменту або обома причинами разом.

Більшість субстратів мають кислотні чи основні групи, тому рН впливає ступінь іонізації субстрату. Фермент переважно зв'язується або з іонізованою або неіонізованою формою субстрату. Вочевидь, при оптимальному рН і функціональні групи активного центру перебувають у найбільш реакційноздатному стані, і субстрат перебуває у формі, кращої зв'язування цими групами ферменту.

При побудові кривих, що описують залежність активності ферменту від рН, вимірювання при всіх значеннях рН зазвичай проводять в умовах насичення ферменту субстратом, оскільки величина K m багатьох ферментів змінюється зі зміною рН.

Крива, що характеризує залежність активності ферменту від рН, може мати особливо просту форму в тих випадках, коли фермент діє електростатично нейтральні субстрати або субстрати, у яких заряджені групи не відіграють істотної ролі в каталітичному акті. Прикладом таких ферментів є папаїн, а також інвертаза, що каталізує гідроліз нейтральних молекул сахарози і зберігає постійну активність в інтервалі рН 3,0-7,5.

Значення рН, що відповідає максимальній активності ферменту, не обов'язково збігається зі значенням рН, характерним для нормального внутрішньоклітинного оточення цього ферменту; останнє може бути як вищим, так і нижче оптимуму рН. Це дозволяє припустити, що вплив рН на активність ферменту може бути одним із факторів, відповідальних за регулювання ферментативної активності усередині клітини. Оскільки в клітині містяться сотні ферментів, і кожен із них по-різному реагує на зміну рН, значення рН усередині клітини є, можливо, одним із важливих елементів у складній системі регуляції клітинного метаболізму.

2.3 Визначення кількості ферменту з його активності

) загальну стехіометрію каталізованої реакції;

) можливу потребу в кофакторах - в іонах металів чи коферментах;

) залежність активності ферменту від концентрацій субстрату та кофактора, тобто. величини K m як субстрату, так кофактора;

) значення рН, що відповідає максимальній активності ферменту;

) область температур, у яких фермент стійкий і зберігає високу активність.

Крім того, необхідно мати у своєму розпорядженні якусь досить просту аналітичну методику, що дозволяє визначати швидкість зникнення субстрату або швидкість появи продуктів реакції.

Завжди, коли це можливо, аналіз вміст ферменту проводиться в стандартних умовах, за яких підтримується оптимальне значення рН і концентрація субстрату, що перевищує концентрацію насичення; у цьому випадку початкова швидкість відповідає нульовому порядку реакції щодо субстрату та пропорційна лише концентрації ферменту. Для ферментів, що потребують кофакторах - іонах металів або коферментах, концентрація цих кофакторів також повинна перевищувати концентрацію насичення, щоб фактором, що лімітує швидкість реакції, була концентрація ферменту. Зазвичай вимір швидкості утворення продукту реакції може бути проведено з більшою точністю, ніж вимір швидкості зникнення субстрату, так як для підтримки кінетики нульового порядку субстрат, як правило, повинен бути присутнім у порівняно високих концентраціях. Швидкість утворення продукту (або продуктів) реакції можна вимірювати хімічними або спектр фотометричними методами. Другий спосіб зручніший, оскільки він дозволяє безперервно реєструвати хід реакції на лепті самописця.

За міжнародною угодою за одиницю ферментативної активності приймається кількість ферменту, здатне викликати перетворення одного мікромолю субстрату за хвилину при 25°С в оптимальних умовах. Питомою активністюферменту називають число одиниць ферментативної активності для 1 мг білка. Цю величину використовують як критерій чистоти ферментного препарату; вона зростає в міру очищення ферменту і для ідеально чистого препарату досягає максимального значення. Під числом оборотіврозуміють число молекул субстрату, що піддаються перетворенню на одиницю часу для однієї молекулу ферменту (чи однією активний центр) за умов, коли швидкість реакції лімітується концентрацією ферменту.

2.4 Активація ферментів

Регуляція ферментів може здійснюватися шляхом взаємодії з ними різних біологічних компонентів або чужорідних сполук (наприклад, ліків та отрут), які прийнято називати модифікаторамиабо регуляторами ферментів.Під дією модифікаторів на фермент реакція може прискорюватися (активатори) або сповільнюватись (інгібітори).

Активація ферментів визначається прискорення біохімічних реакцій, що настає після дії модифікатора. Одну групу активаторів складають речовини, що впливають область активного центру ферменту. До них відносяться кофактори ферментів та субстрати. Кофактори (іони металів і коферменти) не лише обов'язковими структурними елементами складних ферментів, а й у суті їх активаторами.

Іони металів бувають досить специфічними активаторами. Часто для деяких ферментів потрібні іони не одного, а кількох металів. Наприклад, для Na + , K + -АТФази, що здійснює транспорт одновалентних катіонів через клітинну мембрану, необхідні активаторів іони магнію, натрію і калію.

Активація за допомогою іонів металів здійснюється за різними механізмами. У деяких ферментах вони входять до складу каталітичної ділянки. У ряді випадків іони металів полегшують зв'язування субстрату з активним центром ферменту, утворюючи своєрідний місток. Нерідко метал з'єднується не з ферментом, а з субстратом, утворюючи металосубстратний комплекс, який є кращим для дії ферменту.

Специфічністю участі коферментів у зв'язуванні та каталізі субстрату пояснюється активація ними ферментативних реакцій. Особливо помітно активує вплив кофакторів при дії на фермент, який не насичений кофакторами.

Субстрат також у відомих межах концентрацій є активатором. Після досягнення насичуючих концентрацій субстрату активність ферменту не зростає. Субстрат підвищує стабільність ферменту та полегшує формування необхідної конформації активного центру ферменту.

Іони металів, коферменти та їх попередники та активні аналоги,

субстрати можна використовувати практично як препарати, активують ферменти.

Активація деяких ферментів може здійснюватися шляхом модифікації, що не торкається активного центру їх молекул. Можливо кілька варіантів такої модифікації:

1) активація неактивного попередника - проферменту,або зимогену. Наприклад, перетворення пепсиногену на пепсин ;

2) активація шляхом приєднання будь-якої специфічної модифікуючої групи до молекули ферменту;

3) активація шляхом дисоціації неактивного комплексу білок – активний фермент.

2.5 Інгібування ферментів

Існують реагенти, здатні взаємодіяти більш-менш специфічно з тим або іншим боковим ланцюгом білків, що призводить до інгібування активності ферменту. Це дозволяє вивчати природу амінокислотних бічних залишків, що беруть участь у даній ферментативної реакції. Однак на практиці слід враховувати численні тонкощі, що роблять однозначну інтерпретацію результатів, отриманих зі специфічними інгібіторами, досить важкою і найчастіше сумнівною. Перш за все, щоб реакція з інгібітором підходила для вивчення природи бічних ланцюгів, що беруть участь у реакції, вона повинна задовольняти наступним критеріям:

) бути специфічною, тобто. інгібітор повинен блокувати лише потрібні групи;

) інгібувати активність ферменту, і це інгібування має ставати повним зі збільшенням числа модифікованих груп;

) реагент не повинен викликати неспецифічну денатурацію білка.

Виділяють 2 групи інгібіторів: оборотної та необоротної дії. В основі підрозділу лежить критерій відновлення активності ферменту після діалізу чи сильного розведення розчину ферменту з інгібітором.

За механізмом дії виділяють конкурентне, неконкурентне, безконкурентне, субстратне та алостеричне інгібування.

Конкурентне інгібування

Конкурентне інгібування було відкрито щодо інгібування, викликаного аналогами субстрату. Це гальмування ферментативної реакції, викликане зв'язуванням з активним центром ферменту інгібітора подібного за структурою субстратом і що перешкоджає утворенню фермент-субстратного комплексу. При конкурентному гальмуванні інгібітор та субстрат, будучи подібними до будови, конкурують за активний центр ферменту. З активним центром зв'язується те з'єднання молекул, якого більше.

Такі уявлення про механізм інгібування були підтверджені експериментами з кінетики реакцій конкурентного інгібування. Так, було показано, що у разі конкурентного інгібування аналог субстрату не впливає на швидкість розкладання комплексу, що вже утворився фермент-субстрат, тобто. при використанні «нескінченно великого» надлишку субстрату виходить та сама максимальна швидкість як у присутності, і відсутність інгібітора. Навпаки, інгібітор впливає величину константи дисоціації і константи Міхаеліса. З цього можна зробити висновок, що інгібітор реагує з групами білка, що беруть участь тим чи іншим чином у зв'язуванні субстрату, отже, через взаємодію його з цими групами міцність зв'язування субстрату зменшується (тобто зменшується кількість молекул ферменту, здатних зв'язувати субстрат) .

Пізніше було показано, що кінетично конкурентне інгібування може бути викликане як аналогами субстратів, а й іншими реагентами, хімічна структура яких абсолютно відрізняється від структури субстрату. У цих випадках також передбачалося, що цей реагент взаємодіє з групою, яка відповідає за зв'язування субстрату.

Для конкурентного інгібування теоретично можуть бути дві можливості:

1)зв'язувальні та каталітичні центри ферменту перекриваються; інгібітор зв'язується з ними, але впливає лише на групи центру зв'язування;

2) центр зв'язування та каталітичний центр у молекулі ферменту просторово відокремлені; інгібітор взаємодіє із центром зв'язування.

де I - інгібітор, а K I - константа дисоціації комплексу; фермент - інгібітор.

Відносна швидкість (відношення швидкості ферментативної реакції, виміряної у присутності інгібітора (v i) , до максимальної швидкості) дорівнює

v i / V = ​​/ [E] T

оскільки для загальної концентрації ферменту справедливо

[E] T = [E] + +

то 1 / v i = (K s / V [S]) (1 + [I] / K I) + 1 / V

Очевидно, якщо [I] = K I , то нахил прямої лінії стає вдвічі більше, ніж для залежності 1/v 0 від [S] (v 0 - швидкість ферментативної реакції у відсутності інгібітору).

Тип пригнічення зазвичай визначають графічно. Конкурентне інгібування найлегше розпізнається шляхом побудови графіків Лайнуівера - Берка (тобто графіків у координатах 1/v i та 1/[S]) при різних концентраціях інгібітору. При істинному конкурентному інгібуванні виходить набір прямих, що відрізняються тангенсом кута нахилу та перетинають вісь ординат (вісь 1/v i) в одній точці. При будь-якій концентрації інгібітору можна використовувати настільки високу концентрацію субстрату, що активність ферменту буде максимальною.

Як приклад конкурентного інгібування можна навести вплив різних речовин на активність сукцинатдегідрогенази. Цей фермент входить до складу ферментної циклічної системи – циклу Кребса. Його природним субстратом є сукцинат, а подібним до нього конкурентним інгібітором - оксалоацетат, проміжний продукт того ж циклу Кребса:

Аналогічним конкурентним інгібітором сукцинатдегідрогенази є малонова кислота, що часто використовується в біохімічних дослідженнях.

На принципі конкурентного інгібування засновано дію багатьох фармакологічних препаратів, отрутохімікатів, що використовуються для знищення сільськогосподарських шкідників та бойових отруйних речовин.

Наприклад, група антихолінестеразних препаратів, до яких відносяться похідні четвертинних амонієвих основ та фосфорорганічні сполуки, є конкурентними інгібіторами ферменту холінестерази щодо його субстрату ацетилхоліну. Холінестераза каталізує гідроліз ацетилхоліну – медіатора холінергічних систем (нервово-м'язових синапсів, парасимпатичної системи тощо). Антихолінестеразні речовини конкурують з ацетилхоліном за активний центр ферменту, зв'язуються з ним та вимикають каталітичну активність ферменту. Такі препарати, як прозерин, фізостигмін, севін, пригнічують фермент оборотно, а фосфорорганічні препарати типу армину, нібуфіну, хлорофосу, зоману діють незворотно, фосфорилуючи каталітичну групу ферменту. Через війну дії накопичується ацетилхолин у тих синапсах, де є медіатором нервового порушення, тобто. відбувається отруєння організму накопиченим ацетилхоліном. Дія оборотних інгібіторів поступово проходить, тому що чим більше накопичується ацетилхоліну, тим швидше він витісняє інгібітор з активного центру холінестерази. Токсичність необоротних інгібіторів незрівнянно вища, тому їх застосовують для боротьби зі шкідниками сільського господарства, побутовими комахами та гризунами (наприклад, хлорофос) та як бойові отруйні речовини (наприклад, зарин, зоман та ін.).

Неконкурентне інгібування

При неконкурентному пригніченні специфічний інгібітор не впливає на константу дисоціації комплексу фермент-субстрат. З іншого боку, максимально досяжна швидкість реакції менше у присутності інгібітору, ніж у його відсутність, навіть за нескінченно великого надлишку субстрату. Наявність пригнічення доводить, що інгібітор зв'язується з білком. Незмінність константи дисоціації як у присутності, і відсутність інгібітора своєю чергою свідчить про те, що на відміну субстрату інгібітор пов'язується з інший групою. З теоретичної точки зору механізм подібного інгібування може бути інтерпретований різними способами.

а) Центр зв'язування та каталітичний центр ферменту різні. У цьому випадку інгібітор, пов'язаний з каталітичним центром, зменшує активність ферменту та максимально досягається
швидкість, не впливаючи на утворення комплексу ферменту із субстратом.

б) Центр зв'язування та каталітичний центр перекриваються на
поверхні ферменту, а інгібітор пов'язують з іншими групами білка. Завдяки зв'язуванню інгібітору з поверхнею ферменту інформація білка змінюється та стає несприятливою для здійснення каталізу.

в) Інгібітор не зв'язується ні з каталітичним центром, ні з центром зв'язування і не впливає на конформацію білка. Проте він може локально змінювати розподіл заряду на ділянці поверхні білка. Інгібування активності може відбуватися і в цьому випадку, якщо, наприклад, унеможливлюється іонізація груп, суттєвих для прояву активності, або якщо навпаки відбувається іонізація груп, активних тільки в неіонізованій формі. Таке явище спостерігається головним чином при використанні сильнокислих або лужних реагентів.

Інгібітор та субстрат не впливають на зв'язування один одного з ферментом, але комплекси ферменту, що містять інгібітор, абсолютно неактивні. У такому разі можна припустити такі елементарні стадії:

v i / V = ​​/ [E] T

[E] T = [E] + + +

/ v i = (K s / V [S]) (1 + [I] / K I) + (1 / V) (1 + [I] / K I)

Якщо [I] = K I величини нахилів прямих та ординати точки перетину з вертикальною віссю подвоюються порівняно з 1/v 0 .

Неконкурентними інгібіторами є, наприклад, ціаніди, які міцно з'єднуються з тривалентним залізом, що входить до каталітичної ділянки гемінового ферменту – цитохромоксидази. Блокада цього ферменту вимикає дихальний ланцюг і клітина гине. До неконкурентних інгібіторів ферментів відносяться іони важких металів та їх органічні сполуки. Тому іони важких металів ртуті, свинцю, кадмію, миш'яку та інших дуже токсичні. Вони блокують, наприклад, SH-групи, що входять до каталітичної ділянки ферменту.

Неконкурентними інгібіторами є ціаніди, які міцно з'єднуються з тривалентним залізом, що входить до каталітичної ділянки гемінового ферменту – цитохромоксидази. Блокада цього ферменту вимикає дихальний ланцюг і клітина гине. Зняти дію неконкурентного інгібітора надлишком субстрату (як дію конкурентного) не можна, а можна лише речовинами, що зв'язують інгібітор – реактиватори.

Неконкурентні інгібітори застосовуються як фармакологічні засоби, що отруюють речовини для боротьби зі шкідниками сільського господарства та у військових цілях. У медицині застосовуються препарати, що містять ртуть, миш'як, вісмут, які неконкурентно пригнічують ферменти в клітинах організму або хвороботворних бактерій, чим і визначається той чи інший їхній ефект. При інтоксикації зв'язування отрути або її витіснення з комплексу фермент-інгібітор можливе за допомогою реактиваторів. До них відносяться всі SH-місткі комплексони (цистеїн, димеркаптопропанол), лимонна кислота, етилендіамінтетраоцтова кислота та ін.

Безконкурентне інгібування

Цей тип інгібування у літературі називають також антиконкурентним або пов'язаним інгібуванням , однак термін "безконкурентне інгібування" використовується найбільш широко. Характеристикою цього інгібування є те, що інгібітор не здатний приєднуватися до ферменту, але він приєднується до комплексу фермент-субстрат.

У разі безконкурентного інгібування комплекс, що містить інгібітор, неактивний:

v i / V = ​​/ [E]

[E] T = [E] + +

/ v i = K s / V [S] + (1 / V) (1 + [I] / K I)

Субстратне інгібування

Субстратним пригніченням називається гальмування ферментативної реакції, викликане надлишком субстрату. Таке інгібування відбувається внаслідок утворення фермент-субстратного комплексу, не здатного зазнавати каталітичних перетворень, Комплекс ES 2 непродуктивний і робить молекулу ферменту неактивною. Субстратне гальмування викликане надлишком субстрату, тому знімається зі зниженням його концентрації.

Алостеричне інгібування

Алостерична регуляція характерна лише для особливої ​​групи ферментів із четвертинною структурою, що мають регуляторні центри для зв'язування алостеричних ефекторів. Негативні ефектори, які гальмують перетворення субстрату в активному центрі ферменту, виступають у ролі алостеричних інгібіторів. Позитивні алостеричні ефектори, навпаки, прискорюють ферментативну реакцію, і тому їх відносять до алостеричних активаторів. Алостеричними ефекторами ферментів найбільше часто виступають різні метаболіти, а також гормони, іони металів, коферменти. У поодиноких випадках роль алостеричного ефектора ферментів виконують молекули субстрату.

Механізм дії алостеричних інгібіторів на фермент полягає у зміні конформації активного центру. Зниження швидкості ферментативної реакції є наслідком збільшення K m , або результатом зниження максимальної швидкості V max при тих же насичуючих концентраціях субстрату, тобто. фермент частково працює вхолосту.

Алостеричні ферменти відрізняються від інших ферментів особливою S-подібною кривою залежності швидкості реакції від концентрації субстрату. Ця крива подібна до кривої насичення гемоглобіну киснем, вона свідчить у тому, що активні центри субодиниць функціонують не автономно, а кооперативно, тобто. спорідненість кожного наступного активного центру субстрату визначається ступенем насичення попередніх центрів. Узгоджену роботу центрів зумовлюють алостеричні ефектори.

Алостеричне регулювання проявляється у вигляді інгібування кінцевим продуктом першого ферменту ланцюга. Будова кінцевого продукту після серії перетворення вихідної речовини (субстрату) не схожа на субстрат, тому кінцевий продукт може діяти на початковий фермент ланцюга тільки як алостеричний інгібітор (ефектор). Зовні така регуляція подібна до регулювання за механізмом зворотного зв'язку і дозволяє контролювати вихід кінцевого продукту, у разі накопичення якого припиняється робота першого ферменту ланцюга. Наприклад, аспартат-карбамоїлтрансфераза (АКТаза) каталізує першу із шести реакцій синтезу цитидинтрифосфату (ЦТФ). ЦТФ – алостеричний інгібітор АКТази. Тому, коли накопичується ЦТФ, відбувається гальмування АКТази та припиняється подальший синтез ЦТФ. Виявлено алостеричну регуляцію ферментів за допомогою гормонів. Наприклад, естрогени є алостеричним інгібітором ферменту глутаматдегідрогенази, що каталізує дезамінування глутамінової кислоти.

Таким чином, навіть найпростіше кінетичне рівняння ферментативної реакції містить кілька кінетичних параметрів, кожен із яких залежить від температури і середовища, в якому протікає реакція.

Інгібітори дозволяють зрозуміти як суть ферментативного каталізу, а й є своєрідним інструментом на дослідження ролі окремих хімічних реакцій, які з допомогою інгібітору даного ферменту можна специфічно вимикати.

3. Деякі пристрої, зручні для визначення початкових швидкостей реакції

До визначення початкових швидкостей реакцій (v0) призводять багато завдань ферментативної кінетики. Основна перевага цього методу в тому, що визначені в початковий момент часу значення v 0 будуть давати найбільш точні уявлення про активність досліджуваних ферментів, оскільки продукти реакції, що накопичуються, не встигають ще надавати інгібуючого впливу на фермент і, крім того, реагує система знаходиться в стані стаціонарної рівноваги .

У лабораторній практиці, однак, при використанні звичайної спектрофотометричної, титриметричної або іншої техніки реєстрації протікання таких реакцій втрачається в кращому разі до 15-20 з початкового часу на внесення ферменту до субстрату, перемішування системи, що реагує, установку осередку і т.п. А це неприпустимо, тому що дотична в цьому випадку наводиться вже в точку, де tg ά 2< tg ά 1 . Не компенсируется потеря начального времени и при математической обработке таких кривых при записи выхода v 0 на максимальный уровень (V). Кроме того, протекание реакций без постійного перемішування ускладнюється ще флуктуаціями концентрацій реагентів за обсягом.

Прості пристрої, що пропонуються нижче, до спектрофотометра, рН-метра тощо дозволяють значною мірою знизити джерела зазначених похибок визначення v 0 .

3.1 Пристрій до спектрофотометру

Пристрій спектрофотометр складається з дозатора 1, що обертається тефлонової нитки 2 (мішалка) і кришки-фіксатора 3.

Дозатор - це мікропіпетка, один кінець якої оформляється голкою 4, другий - розширенням 5 (для запобігання попаданню ферменту в гумовий наконечник 6).

У тефлонової кришці 3, що закриває спектральну кювету 7, є два отвори: один (8) у центрі кришки, другий (9) над серединою проміжку між непрозорою стінкою кювети 7 і променем світла 10. Тефлонова трубка 11 (внутрішній діаметр 1 -1,5 мм) одним кінцем закріплюється в отворі 9, другим - на нерухомому виступі 12 перед ротором мотора 13. Всередину трубки вводиться нитка 2 тефлонова (товщина нитки 0,5-0,6 мм). Один кінець нитки зміцнюється на роторі, що обертається, мотора 13, другий - пропущений в кювету 7 - оформляється у вигляді спіралі (для посилення перемішування). Положення нитки визначає кришка-фіксатор 3 незалежно від видалення двигуна, що зручно при роботі, що вимагає частої зміни кювет.

Принцип роботи.Кварцова кювета спектрофотометра 7 наповнюється субстратом 14 (близько 1,5-2,0 мл), вставляється в термостатичний кюветоутримувач спектрофотометра, закривається кришкою 3 з тефлонової ниткою 2, що обертається, яка занурюється в субстрат 14, і всі подальші операції та реєструються на самописці.

На початку роботи здійснюється перемішування субстрату, і перо самописця пише рівну горизонтальну (або нульову) лінію. Дозатор (з ферментом) вставляється в отвір 8 (голка занурюється в розчин субстрату 14), швидким стисканням наконечника 6 фермент (зазвичай близько 0,03-0,05 мл) вводиться субстрат, і дозатор видаляється. Перемішування компонентів закінчується за 2,5-3, і перо самописця фіксує початок реакції відхиленням кривої залежності оптичної щільності (ΔА) від часу.

Таке пристосування дозволяє відбирати проби з реагуючої системи на аналіз; вносити до системи добавки інгібіторів та активаторів; змінювати умови перебігу реакцій (змінювати рН, іонну силу тощо) без порушення реєстрації перебігу реакцій, що виявляється дуже зручним, наприклад, при дослідженні розщеплення n-НФФ «кислими» фосфатазами, де розщеплення n-НФФ проводять при рН 5,0 (або рН 6-7), а активність ферментів визначають за накопиченням n-нітрофенолят іонів при рН 95-100.

Зручно такий пристрій для проведення спектрофотометричного титрування ферментів і т.п.

3.2 Пристрій до рН-метру

Пристрій до рН-метра складається з модифікованого наконечника проточного електрода 1, полумикроячейки 2, 3 дозатора і електронної схеми підключення рН-метра до самописця. Крім того, пристрій включає стандартний електрод рН-метра (4), кришку-тримач комірки (5), проточну термостатічну камеру (6), розчин субстрату (7), пасивний магніт (8), активний магніт (9).

Стандартний наконечник проточного електрода рН-метра (ЛПУ-01) замінюється на тефлонову трубку 1 (внутрішній діаметр 1,3-1,5 мм), заповнюється азбестовою ниткою, попередньо обробленою насиченим розчином KCl. Щільність заповнення нитки регулюється таким чином, щоб швидкість протоки розчину KCl через трубку була близька до швидкості протоки вихідного немодифицированного електрода. Така заміна наконечника дозволяє знизити розміри вихідного робочого осередку з 20-25 до 2 мл, що дозволяє обходитися мінімальними обсягами (1,5 мл) розчинів дорогих біохімічних препаратів.

Електронна схема підключення рН-метра (ЛПУ-01) до самописця складається з джерела живлення (батареї постійного струму 12), змінного дротяного опору R 1 (10 - 100 Ом), що задає за показанням вольтметра напруга 9 на стабілотроні Д809, змінного дроту опору R 2 (15-150 Ом), що регулює установку «нуля» (початку відліку) показань рН-метра на шкалі самописця, та змінного дротяного опору R 3 (35-500 Ом), що регулює масштаб розширення (посилення) показань шкали рН- метра на самописці. Схема працює надійно до падіння напруги джерела не нижче 9 ст.

Принцип роботи.У комірку (скляний циліндр 1,7х2,4 см) вноситься 1,5 мл субстрату, і комірка закріплюється на кришці-фіксаторі 5. Включається перемішування 9 і перо самописця пише рівну (базову) лінію відліку. За допомогою дозатора 0,03 мл розчину ферменту вноситься в субстрат і перо самописця фіксує початок реакції відхиленням кривої залежності рН від часу (t).

Такий пристрій не замінює рН-стату, але з огляду на можливість розширення шкали рН-метра дозволяє надійно фіксувати незначні зміни рН 0,004-0,005.

3.3 Номограмні лінійки, зручні визначення початкової швидкості

Значну трудомісткість визначень початкової швидкості методом дотичних становить підрахунок відносин зміни концентрацій реагентів (Δ[S]) за одиницю часу (Δt), тобто. вираз v 0 М/хв з умов, що

v 0 = lim Δ[S] / Δt, при t 0.

Насправді така процедура складається зазвичай з трьох-чотирьох окремих операцій: проводять дотичну до початковій ділянці кривої ходу реакції, потім підраховують число одиниць реєстрованої величини (оптична щільність, кут обертання тощо), що припадають на певний інтервал часу, наводять це до одиниці часу і, нарешті, роблять перерахунок показань самописця зміну концентрацій реагенту за 1 хв (М/мин). Пропоновані два типи номограмної лінійки дозволяють спростити цю процедуру.

Прямокутна лінійка. v 0 є відношення Δ[S]/Δt, тобто. tg ά, де ά - кут нахилу дотичної до осі часу t. Ця ж дотична є гіпотенузою відповідного прямокутного трикутника з катетами [S] іt. Чим більше v 0 тим крутіше нахил дотичної. Отже, якщо ми обмежимося певним інтервалом часу, наприклад 1 хв, отримаємо серію прямокутних трикутників з різною величиною катета [S] (насправді різною величиною v 0). Якщо ж проградуювати обидва катета: горизонтальний - в одиницях відліку часу (1 хв), а вертикальний - в одиницях зміни концентрацій реагенту, наприклад в мілімолях (мМ), і нанести отримані відрізки на відповідний формат із прозорого матеріалу (оргскло завтовшки близько 2 мм) , можна отримати зручну лінійку визначення початкових швидкостей реакцій. Усі цифри та лінії наносяться на звороті лінійки, щоб виключити похибки на паралакс при визначеннях v 0 .

Процедура визначення v0 скорочується в цьому випадку до двох простих операцій: до початкової ділянки кінетичної кривої t проводять дотичну 2 і поєднують нульову точку горизонтального катета t лінійки з початком дотичної, продовження дотичної перетне тепер шкалу концентрацій [S] у точці, що визначає значення v 0 М/хв (при горизонтальному положенні катета t на. Ніяких додаткових операцій більше не потрібно.

Дугова лінійка.Процедуру визначення v0 можна спростити до однієї операції, якщо шкалу концентрацій відкласти по дузі певного радіусу.

На пластинку з прозорого матеріалу наносять пряму («базисну») лінію 2 (усі цифри та лінії також наносять на звороті лінійки) та з нульової точки (t=0, хв) цієї лінії радіусом, рівним довжині катета t=1 хв [ , проводять дугу [S], зверху вниз по якій відкладають шкалу зміни концентрацій реагенту (наприклад, субстрату мМ).

Описані типи лінійок, пристрій спектрофотометру і рН-метру протягом кількох років використовуються визначення початкових швидкостей реакцій (v 0), щодо субстратной специфічності ферментів, для спектрофотометрического титрування тощо.

Висновок

У цьому роботі було розглянуто розділ ензимології, вивчає залежність швидкості хімічних реакцій, каталізованих ферментами, від чинників довкілля. Основоположниками цієї науки по праву вважаються Міхаеліс і Ментен, які опублікували свою теорію загального механізму ферментативних реакцій, що вивели рівняння, що стало фундаментальним принципом всіх кінетичних досліджень ферментів, воно є відправною точкою за будь-якого кількісного опису дії ферментів. Вихідне рівняння Міхаеліса – Ментен є рівнянням гіперболи; свій внесок у кінетику внесли Лайнуівер і Берк, які перетворили рівняння Міхаеліса – Ментен та отримали графік прямий, за якою можна найточніше визначити значення V max .

З часом зміна швидкості ферментативної реакції в ферментативної реакції в експериментальних умовах зменшується. Зниження швидкості може відбуватися за рахунок низки факторів: зменшення концентрації субстрату, збільшення концентрації продукту, який може інгібувати, можуть відбуватися зміни рН розчину, зміни температури середовища. Так, при підвищенні температури на кожні 10°С швидкість реакції збільшується в 2 рази і навіть менше. Низька температура оборотно інактивує ферменти. Залежність швидкості ферментативної реакції від рН свідчить про стан функціональних груп активного центру ферменту. Кожен фермент по-різному реагує зміну рН. Хімічні реакції можна зупиняти шляхом на них різними видами ингибирования. Початкову швидкість реакції можна швидко і точно визначити за допомогою таких пристроїв, як номограмні лінійки, пристрій спектрофотометру і рН-метру. Це дозволяє найточніше уявити активність досліджуваних ферментів.

Все це активно використовується в наші дні у медичній практиці.

Список використаних джерел

1. Бєлясова Н.А. Біохімія та молекулярна біологія. – Мн.: книжковий будинок, 2004. – 416 с., іл.

Келеті Т. Основи ферментативної кінетики: Пров. з англ. - М: Мир, 1990. -350 с., іл.

3. Кнорре Д.Г. Біологічна хімія: Навч. для хім., біол. та мед. спец. вузів. - 3-тє вид., Випр. - М: Вища. шк. 2002. – 479 с.: іл.

4. Круп'яненко В.І. Векторний метод представлення ферментативних реакцій. - М: Наука, 1990. - 144 с.

5. Ленінджер А. Біохімія. Молекулярні основи структури та функції клітини: Пер. з англ. - М: Мир, 1974.

6. Строєв Є.А. Біологічна хімія: Підручник для фармац. ін-тів та фармац. фак. мед. ін-тов. - М: Вища школа, 1986. - 479 с., іл.

Северін Є.С. Біохімія. а. - 5-те вид. – М.: ГЕОТАР – Медіа, 2009. – 786 с., іл.

Ферментативна кінетика вивчає швидкість реакцій, що каталізуються ферментами залежно від різних умов (концентрації, температури, рН та ін.) їх взаємодії з субстратом.

Проте ферменти – це білки, чутливі до впливу різних зовнішніх впливів. Тому щодо швидкості ферментативних реакцій враховують, головним чином, концентрації реагуючих речовин, а вплив температури, pH середовища, активаторів, інгібіторів та інших чинників намагаються звести до мінімуму і створюють стандартні умови. По-перше, це оптимальне для цього ферменту значення pH середовища. По-друге, рекомендується дотримуватись температури 25°С, у тих випадках, де це можливо. По-третє, досягають повного насичення ферменту субстратом. Цей момент особливо важливий, оскільки при низькій концентрації субстрату не всі молекули ферменту беруть участь у реакції (рис. 6.5, а), отже результат буде далекий від максимально можливого. Найбільша потужність реакції, що каталізується, за інших рівних умов, досягається, якщо кожна молекула ферменту бере участь у перетворенні, тобто. при високій концентрації фермент-субстратного комплексу (рис. 6.5, в).Якщо концентрація субстрату не забезпечує повного насичення ферменту (рис. 6.5, б), то швидкість реакції не досягає максимального значення.

Рис. 65.

а -при низькій концентрації субстрату; 6 - при недостатній концентрації субстрату; в -при повному насиченні ферменту субстратом

Швидкість ферментативної реакції, виміряної при дотриманні перелічених умов, та повне насичення ферменту субстратом називають максимальною швидкістю ферментативної реакції (V).

Швидкість ферментативної реакції, яка визначається при неповному насиченні ферменту субстратом, позначається v.

Ферментативний каталіз спрощено можна описати схемою

де F – фермент; S – субстрат; FS – фермент-субстратний комплекс.

Кожна стадія цього процесу характеризується певною швидкістю. Одиницею вимірювання швидкості ферментативної реакції служить кількість молей субстрату, що перетворюється на одиницю часу(як і швидкість нормальної реакції).

Взаємодія ферменту із субстратом призводить до утворення фермент-субстратного комплексу, але цей процес оборотний. Швидкості прямої та зворотної реакцій залежать від концентрацій реагуючих речовин та описуються відповідними рівняннями:

У стані рівноваги справедливе рівняння (6.3), оскільки швидкості прямої та зворотної реакції рівні.

Підставивши значення швидкості прямої (6.1) та зворотної (6.2) реакції в рівняння (6.3), отримаємо рівність:

Стан рівноваги характеризується відповідною константою рівноваги К р,рівною відношенню констант прямої та зворотної реакцій (6.5). Величина, обернена до константи рівноваги, називається субстратною константою K s ,або константою дисоціації фермент-субстратного комплексу:

З рівняння (6.6) ясно, що субстратна константа зменшується за високої концентрації фермент-субстратного комплексу, тобто. за великої його стійкості. Отже, субстратна константа характеризує спорідненість ферменту та субстрату та співвідношення констант швидкостей освіти та дисоціації фермент-субстратного комплексу.

Явище насичення ферменту субстратом вивчали Леонор Міхаеліс та Мод Мептен. На основі математичної обробки результатів ними було виведено рівняння (6.7), яке отримало їх імена, з якого ясно, що при високій концентрації субстрату та низькому значенні субстратної константи швидкість ферментативної реакції прагне максимальної. Однак це рівняння має обмежений характер, оскільки враховує не всі параметри:

Фермент-субстратний комплекс у процесі реакції може піддаватися перетворенням у різних напрямках:

• дисоціювати на вихідні речовини;
• перетворюватися на продукт, від якого відділяється фермент у незмінному вигляді.

Тому для опису сумарної дії ферментативного процесу запроваджено поняття константи Міхаеліса К т,яка висловлює взаємозв'язок констант швидкостей всіх трьох реакцій ферментативного каталізу (6.8). Якщо обидва доданки розділити на константу швидкості реакції утворення фермент-субстратного комплексу, то вийде вираз (6.9):

З рівняння (6.9) випливає важливий наслідок: константа Міхаеліса завжди більша за субстратну константу на величину k 2 /k v

Чисельно До тдорівнює такий концентрація субстрату, коли він швидкість реакції становить половину максимально можливої ​​швидкості і відповідає такому насичення ферменту субстратом, як у рис. 6.5, б.Оскільки на практиці не завжди вдається досягти повного насичення ферменту субстратом, то саме До твикористовується для порівняльної характеристики кінетичних характеристик ферментів.

Швидкість ферментативної реакції при неповному насиченні ферменту субстратом (6.10) залежить від концентрації фермент-субстратного комплексу. Коефіцієнтом пропорційності служить константа реакції звільнення ферменту та продукту, оскільки при цьому змінюється концентрація фермент-субстратного комплексу:

Після перетворень, з урахуванням представлених вище залежностей, швидкість ферментативної реакції при неповному насиченні ферменту субстратом описується рівнянням (6.11), тобто. залежить від концентрацій ферменту, субстрату та їх спорідненості K s:

Графічна залежність швидкості ферментативної реакції від концентрації субстрату не є лінійною. Як очевидно з рис. 6.6 зі збільшенням концентрації субстрату спостерігається зростання активності ферменту. Однак при досягненні максимального насичення ферменту субстратом швидкість ферментативної реакції стає максимальною. Отже, фактором, що обмежує швидкість реакції, є утворення фермент-субстратного комплексу.

Практика показала, що концентрації субстратів, як правило, виражаються значеннями набагато менше одиниці (10 6 -10 3 моль). Оперувати такими величинами у розрахунках досить складно. Тому Г. Лайнуівер і Д. Берк запропонували виражати графічну залежність швидкості ферментативної реакції над прямих координатах, а зворотних. Вони виходили з припущення, що для рівних величин рівні і обернені їм значення:

Рис. 6.6.

Після перетворення виразу (6.13) виходить вираз, званий рівнянням Лайнуівера - Берка (6.14):

Графічна залежність рівняння Лайнуівера-Берка носить лінійний характер (рис. 6.7). Кінетичні характеристики ферменту визначаються так:

• відрізок, що відсікається на осі ординат, дорівнює 1/V;
• відрізок, що відсікається на осі абсцис, дорівнює -1 /До т.п.

Рис. 6.7.

Вважається, що метод Лайнуівера – Берка дозволяє точніше, ніж у прямих координатах, визначити максимальну швидкість реакції. З цього графіка можна також отримати цінну інформацію щодо інгібування ферменту.

Існують і інші способи перетворення рівняння Міхаеліса-Ментен. Графічні залежності використовують щодо впливу різних зовнішніх впливів на ферментативний процес.

Ферментативна кінетика вивчає вплив різних факторів (концентрація S та E, рН, температура, тиск, інгібітори та активатори) на швидкість ферментативних реакцій. Головною метою вивчення кінетики ферментативних реакцій є отримання інформації, що дозволяє глибше зрозуміти механізм дії ферментів.

Кінетична крива дозволяє визначити початкову швидкість реакції V0.

Крива субстратного насичення.

Залежність швидкості реакції від концентрації ферменту.

Залежність швидкості реакції від температури.

Залежність швидкості реакції від рН.

Оптимум рН дії більшості ферментів лежить у межах фізіологічних значень 6,0-8,0. Пепсин активний при рН 15-20, що відповідає кислотності шлункового соку. Аргіназа, специфічний фермент печінки, активний за 10,0. Вплив рН середовища на швидкість ферментативної реакції пов'язують із станом та ступенем іонізації іоногенних груп у молекулі ферменту та субстрату. Цей фактор визначає конформацію білка, стан активного центру та субстрату, формування фермент-субстратного комплексу, власне процес каталізу.

Математичний опис кривої субстратного насичення, константа Міхаеліса .

Рівняння, що описує криву субстратного насичення, було запропоновано Міхаелісом та Ментоном і носить їх імена (рівняння Міхаеліса-Ментен): V = (V MAX *[ S])/(Km+[ S]) де Km – константа Міхаеліса. Легко розрахувати, що з V = V MAX /2 Km = [S], тобто. Km – це концентрація субстрату, за якої швидкість реакції становить ½ V MAX . З метою спрощення визначення величини V MAX та Km рівняння Міхаеліса-Ментен можна перерахувати. 1/V = (Km+[S])/(V MAX * [S]), 1/V = Km/(V MAX *[S]) + 1/V MAX ,

1/ V = Km/ V MAX *1/[ S] + 1/ V MAXрівняння Лайнуівера-Берка. Рівняння, що описує графік Лайнуівера-Берка – це рівняння прямої лінії (y = mx + c), де 1/V MAX – це відрізок, що відсікається прямою на осі ординат; Km/V MAX - тангенс кута нахилу прямого; перетин прямий з віссю абсцис дає величину 1/km. Графік Лайнуівера-Берка дозволяє визначити Km щодо відносно невеликого числа точок. Цей графік також використовують при оцінці дії інгібіторів, що буде сказано нижче. Значення Km змінюються у межах: від 10 -6 моль/л для дуже активних ферментів, до 10 -2 – для малоактивних ферментів.

Оцінки Km мають практичну цінність. При концентраціях субстрату в 100 разів перевищують Km, фермент буде працювати практично з максимальною швидкістю, тому максимальна швидкість V MAX відображатиме кількість активного ферменту. Цю обставину використовують для оцінки вмісту ферменту препарату. Крім того, Km є характеристикою ферменту, що використовується для діагностики ензимопатії.

Інгібування активності ферментів.

Надзвичайно характеристикою та важливою особливістю ферментів є їхня інактивація під впливом певних інгібіторів.

Інгібітори - Це речовини, що викликають часткове або повне гальмування реакцій, що каталізуються ферментами.

Інгібування ферментативної активності може бути незворотним або оборотним, конкурентним чи неконкрентним.

Необоротне інгібування - це стійка інактивація ферменту, що виникає в результаті ковалентного зв'язування молекули інгібітора в активному центрі або в іншому спеціальному центрі, що змінює конформацію ферменту. Дисоціація таких стійких комплексів з регенерацією вільного ферменту практично виключена. Для подолання наслідків такого пригнічення організм повинен синтезувати нові молекули ферменту.

Оборотне інгібування – характеризується рівноважним комплексоутворенням інгібітора з ферментом з допомогою нековалентних зв'язків, унаслідок чого такі комплекси здатні до дисоціації з відновленням активності ферменту.

Класифікація інгібіторів на конкурентні та неконкурентні заснована на тому, що послаблюється ( конкурентне інгібування ) або не послаблюється ( неконкурентне інгібування ) їх інгібуючу дію при підвищенні концентрації субстрату.

Конкурентні інгібітори – це, зазвичай, сполуки, структура яких подібна до структури субстрату. Це дозволяє їм зв'язуватися у тому активному центрі, як і субстрати, перешкоджаючи взаємодії ферменту з субстратом вже у стадії зв'язування. Після зв'язування інгібітор може бути перетворений на продукт або залишається в активному центрі, поки не відбудеться дисоціація.

Оборотне конкурентне інгібування можна уявити у вигляді схеми:

E↔ E-I → E + P 1

S (неакт)

Ступінь інгібування ферменту визначається співвідношенням концентрацій субстрату та ферменту.

Класичним прикладом подібного типу інгібування є гальмування активності сукцинатдегідрогенази (СДГ) малатом, який витісняє сукцинат із субстратної ділянки та перешкоджає його перетворенню на фумарат:

Ковалентне зв'язування інгібітора в активному центрі призводить до інактивації ферменту (необоротне інгібування). Прикладом незворотного конкурентного інгібування може служити інактивація тріозофосфатізомерази 3-хлорацетолфосфатом. Цей інгібітор є структурним аналогом субстрату – діоксиацетонфосфату та необоротно приєднується до залишку глутамінової кислоти в активному центрі:

Деякі інгібітори діють менш вибірково, взаємодіючи з певною функціональною групою у складі активного центру різних ферментів. Так, зв'язування йодацетату або його аміду з SH-групою амінокислоти цистеїну, що знаходиться в активному центрі ферменту і бере участь у каталізі, призводить до повної втрати активності ферменту:

R-SH + JCH 2 COOH → HJ + R-S-CH 2 COOH

Тому ці інгібітори инактивируют всі ферменти, які мають SH-групи, що у каталізі.

Необоротне інгібування гідролаз при дії нервово-паралітичних газів (зарін, зоман) зумовлено їх ковалентним зв'язуванням із залишком серину в активному центрі.

Метод конкурентного інгібування знайшов широке застосування у медичній практиці. Сульфаніламідні препарати – антагоністи п-амінобензойної кислоти, можуть бути прикладом метаболізованих конкурентних інгібіторів. Вони зв'язуються з дигідроптератсинтетазою – бактеріальним ферментом, що здійснює перетворення п-амінобензоату на фолієву кислоту, необхідну для зростання бактерій. Бактерія гине внаслідок того, що сульфаніламід, що зв'язався, перетворюється на іншу сполуку і фолієва кислота не утворюється.

Неконкурентні інгібітори зазвичай зв'язуються з молекулою ферменту на ділянці, відмінному від місця зв'язування субстрату, і субстрат безпосередньо конкурує з інгібітором. Оскільки інгібітор і субстрат зв'язуються з різними центрами, можлива освіта як комплексу E-I, так і комплексу S-E-I. Комплекс S-E-I теж розпадається з утворенням продукту, проте з меншою швидкістю, ніж E-S, тому реакція сповільнюватиметься, але не зупиниться. Таким чином, можуть протікати наступні паралельні реакції:

E↔ E-I ↔ S-E-I → E-I + P

Оборотне неконкурентне інгібування зустрічається порівняно рідко.

Неконкурентні інгібітори називають алостеричними на відміну від конкурентних ( ізостеричних ).

Оборотне інгібування може бути кількісно вивчене на основі рівняння Міхаеліса-Ментен.

При конкурентному інгібуванні V MAX залишається незмінною, а Km зростає.

При неконкурентному інгібуванні знижується V MAX при постійному Km.

Якщо продукт реакції інгібує фермент, що каталізує його утворення, такий спосіб інгібування називається ретроінгібуванням або інгібуванням за принципом зворотного зв'язку . Наприклад, глюкоза гальмує глюкозо-6-фосфатазу, яка каталізує гідроліз глюкозо-6-фосфату.

Біологічне значення такого інгібування – регулювання певних метаболічних шляхів (див. наступне заняття).

ПРАКТИЧНА ЧАСТИНА

Завдання студентам

1. Вивчити денатурацію білків під дією розчинів мінеральних та органічних кислот та при нагріванні.

2. Виявити кофермент НАД у дріжджах.

3. Визначити амілазну активність у сечі (сироватці крові).

9. ЕТАЛОНИ ВІДПОВІДЕЙ НА ЗАВДАННЯ, тестові питання, що використовуються при контролі знань на занятті (можна у вигляді додатка)

10. ХАРАКТЕР І ОБСЯГ МОЖЛИВОЇ НАВЧАЛЬНО-ДОСЛІДНОЇ РОБОТИ ЗА ТЕМОЮ

(Вказати конкретно характер і форму УІРС: підготовка реферативних виступів, проведення самостійних досліджень, імітаційна гра, оформлення історії хвороби з використанням монографічної літератури та ін.)

Властивості ферментів

1. Залежність швидкості реакції від температури

Залежність активності ферментів (швидкості реакції) від температури описується дзвоноподібною кривоюз максимумом швидкості при значеннях оптимальної температури для даного ферменту. Підвищення швидкості реакції при наближенні до оптимальної температури пояснюється збільшенням кінетичної енергії молекул, що реагують.

Залежність швидкості реакції від температури

Закон про підвищення швидкості реакції в 2-4 рази при підвищенні температури на 10°С справедливий і для ферментативних реакцій, але не більше 55-60°С, тобто. до температур денатураціїбілків. При зниженні температури активність ферментів знижується, але зникає зовсім.

Як виняток є ферменти деяких мікроорганізмів, що існують у воді гарячих джерел і гейзерів, у них оптимум температури наближається до точки кипіння води. Прикладом слабкої активності за низької температури може бути зимова сплячка деяких тварин (суслики, їжаки), температура тіла яких знижується до 3-5°С. Ця властивість ферментів також використовується в хірургічній практиці при проведенні операцій на грудній порожнині, коли хворого охолоджують до 22°С.

Ферменти можуть бути дуже чутливими до зміни температури:

• у сіамських кішок мордочка, кінчики вух, хвоста, лапок чорного кольору. У цих областях температура лише на 0,5°С нижче, ніж у центральних областях тіла. Але це дозволяє працювати ферменту, що утворює пігмент у волосяних цибулинах, при найменшому підвищенні температури фермент інактивується,
• зворотний випадок - при зниженні температури навколишнього повітря у зайця-біляка пігментоутворюючий фермент інактивується і заєць отримує білу шубку,
• противірусний білок інтерферонпочинає синтезуватися в клітинах тільки при досягненні температури тіла 38°С,

Бувають і унікальні ситуації:

• для більшості людей підвищення температури тіла на 5°С (до 42°С) несумісне з життям через дисбаланс швидкості ферментативних реакцій. У той же час у деяких спортсменів виявлено, що при марафонському бігу їхня температура тіла становила близько 40°С, максимальна зареєстрована температура тіла була 44°С.

2. Залежність швидкості реакції від рН

Залежність також описується дзвоноподібною кривоюз максимумом швидкості при оптимальному для даного ферментузначення рН.

Ця особливість ферментів має істотне значення для організму в його адаптації до зовнішніх і внутрішніх умов, що змінюються. Зрушення величини рН поза- і всередині клітини грає роль патогенезі захворювань, змінюючи активність ферментів різних метаболічних шляхів.

Для кожного ферменту існує певний вузький інтервал рН середовища, який є оптимальним для прояву його найвищої активності. Наприклад, оптимальні значення рН для пепсину 1,5-2,5, трипсину 8,0-8,5, амілази слини 7,2, аргінази 9,7, кислої фосфатази 4,5-5,0, сукцинатдегідрогенази 9,0.

Залежність швидкості реакції від величини pH

p align="justify"> Залежність активності від кислотності середовища пояснюється наявністю амінокислот у структурі ферменту, заряд яких змінюється при зрушенні рН (глутамат, аспартат, лізин, аргінін, гістидин). Зміна заряду радикалів цих амінокислот призводить до зміни їхньої іонної взаємодії при формуванні третинної структури білка, зміні його заряду та появі іншої конфігурації активного центру і, отже, субстрат зв'язується або зв'язується з активним центром.

Зміна активності ферментів при зсуві рН може нести і адаптивніфункції. Так, наприклад, у печінці ферменти глюконеогенезу вимагають меншої рН, ніж ферменти гліколізу, що вдало поєднується із закисленням рідин організму при голодуванні чи фізичному навантаженні.

Більшість людей зрушення величини рН крові межі 6,8-7,8 (при нормі 7,35-7,45) несумісні із життям через дисбаланс швидкості ферментативних реакцій. У той самий час деякі марафонців виявлено зниження рН крові наприкінці дистанції до 6,8-7,0. І при цьому вони зберігали працездатність!

3. Залежність кількості ферменту

При збільшенні кількості молекул ферменту швидкість реакції зростає безперервно прямо пропорційно кількості ферменту, т.к. Більша кількість молекул ферменту виробляє більше молекул продукту.